USMC FC "Mess Hall"

[matt mattock]

bhe allora un po possiamo capirci, in pratica la procedura era la seguente:
-prima fase lisaggio di una coltura cellulare di fibroblasti umani in una fiaschetta, prelievo, del lisato, trattamento con vari agenti chimici e varie centrifugazioni ed eliminazione del sovranatante per ottenere il pellets del totale degli RNA
-controllo tramite gel elettroforesi su agarosio per accertare la presenza degli RNA, quindi ovviamente ottieni bandeggi distinti degli RNA ribosomiali 28s 17s e 5s, e tracce opalescenti degli RNA messaggeri espressi in quel momento dalla cellula, oltre ai tRNA, small nuclear RNA e 4,5svedberg dei complessi di riconoscimento delle SRP.
-retrotrascrizione mediante enzima trascrittasi inversa degli RNA messaggeri in cDNA a doppio filamento
-amplificazione mediante PCR con primer specifici disegnati per il cDNA relativo al messaggero per la beta-actina umana (primer dotati di estremità EcoR1 restrizione compatibili)
-gel elettroforesi per testare la buona riuscita della amplificazione e la non presenza di amplificazioni parassita, recupero con bisturi dell'amplificato, risospensione per centrifuga
-preparazione dei plasmidi pBlueScript mediante taglio con enzima di restrizione EcoR1, stessa cosa per i cDNA per ottenere estremità sticky coesive
-gel elettroforesi con controllo per testare l'apertura del vettore plasmidico circolare
-legatura overnight dei plasmidi con gli inserti preparati
-preparazione di colture batteriche di ceppi E.Coli mutanti res- e rec- sincrone alla fase logaritmica precoce della crescità in batch
-trasformazione delle cellule competenti mediante una soluzione trasformante specifica per facilitare l'ingresso di tutti i vettori nelle cellule batteriche (compresi i vettori che si sono richiusi senza inserto)
-piastraggio su terreni selettivi con ampicillina per eliminare i batteri non trasformati (pbluescript porta il genere per la resistenza all'antibiotico ampicillina)
-crescita delle colonie ricombinanti overnight
-prelievo di una colonia controllo dotata di plasmide vuoto e di 3 colonie random trasformate (?) non c'era tempo materiale per fare lo screening mediante sonde marcate radioattivamente, screening per pcr, screening mediante metodo lacZ o altro quindi il quick screening è stato fatto per gel elettroforesi.
semplificato come una storiella di cappuccetto rosso, 1 settimana di lavoro eheheh

Zzzz....Ore 01:30... sonnecchio davanti al computer quando casualmente incappo in ciò che è scritto sopra... leggo... biologia molecolare...mi risveglio un pò... sono un pò tanto arrugginito sull'argomento, ma leggendo con attenzione mi ritornano in mente tante cose (il 90% di ciò che hai scritto l'ho capito, frutto di vecchi studi universitari...bei tempi...)
Purtroppo il metodo qui sopra non funziona proprio per gli equipaggiamenti militari. Ne in vitro ne in vivo.
Probabilmente sei un biologo/bioingegnere/tecnico di lab che ti occupi di biologia molecolare, giusto?
Non so se sei più matto tu a scrivere ste cose su un forum di softair il venerdì sera tardi o io che più tardi le leggo e ti rispondo...mah...forse è meglio farci una dormita su... 1 pecora....2 pecore...3 pecore....zzzz...

[Paolonix]

Zzzz....Ore 01:30... sonnecchio davanti al computer quando casualmente incappo in ciò che è scritto sopra... leggo... biologia molecolare...mi risveglio un pò... sono un pò tanto arrugginito sull'argomento, ma leggendo con attenzione mi ritornano in mente tante cose (il 90% di ciò che hai scritto l'ho capito, frutto di vecchi studi universitari...bei tempi...)
Purtroppo il metodo qui sopra non funziona proprio per gli equipaggiamenti militari. Ne in vitro ne in vivo.
Probabilmente sei un biologo/bioingegnere/tecnico di lab che ti occupi di biologia molecolare, giusto?
Non so se sei più matto tu a scrivere ste cose su un forum di softair il venerdì sera tardi o io che più tardi le leggo e ti rispondo...mah...forse è meglio farci una dormita su... 1 pecora....2 pecore...3 pecore....zzzz...

esattamente futuro (spero non troppo anteriore) dottore in biotecnologie ahahah
il pazzo sono io, non avevo che fare e ho scritto qua a grandi linee quello che avevo fatto in settimana visto che ero stato un po assente nella stanza :P
Tutti speravamo che avrebbe funzionato almeno in vitro, ho tentato di amplificare un paio di M4A1 ma le cellule batteriche pacifiste erano restie ad acquisire materiale bellico XD